La principessa Luna è un unicorno alato, sorella di Celestia. Nella seconda stagione, ella ha un manto di colore blu scuro e nero, gli occhi azzurri e la chioma blu scuro punteggiata di astri, fluente e semitrasparente sui bordi come quella di Celestia; possiede inoltre un portamento regale e una figura sovrastante e più alta della media (analogamente alla sorella). Nella sua prima apparizione[3], invece, la principessa ha un manto più chiaro e la criniera azzurra, ed è di media altezza. Anticamente, come viene narrato nell'introduzione al primo episodio[5], la principessa regnava su Equestria insieme alla sorella maggiore, e il suo compito era far sorgere la luna e far calare la notte. Tuttavia, con il passare del tempo, Luna maturò un sentimento di rancore verso la sorella, in quanto i pony sembravano godere solo del dì portato loro da Celestia, mentre la notte la passavano addormentati. La principessa, un giorno, si ribellò a Celestia rifiutandosi di far tramontare la luna e, a causa dell'amarezza presente nel suo cuore, si trasformò in Nightmare Moon (il nome è anche scritto Night Mare Moon), «un mostro tenebroso»[5]. Celestia fu costretta ad adoperare il potere degli Elementi dell'armonia e a esiliare la sorella all'interno della luna, dove ella rimase prigioniera e in solitudine per mille anni; durante questo periodo, Nightmare Moon appariva come un'enorme figura scura sulla faccia della luna (come un mare lunare)[62]. Nightmare Moon riesce a liberarsi dalla prigionia durante «il giorno più lungo del millesimo anno», come predetto da una vecchia leggenda, e fa la sua comparsa proprio durante la Festa del Sole d'Estate, presagendo ai pony di Ponyville una notte eterna[63]. In mancanza di Princess Celestia, misteriosamente sparita, Twilight e le sue ancora poco conosciute compagne partono alla ricerca degli Elementi dell'armonia, e grazie alla collaborazione e all'amicizia riescono a prevalere su Nightmare Moon, trasformandola di nuovo in Luna; questa, riappacificatasi con Celestia, torna a regnare su Equestria al fianco della sorella[3]. Collegata alla (presunta) leggenda di Nightmare Moon è la festività di Notte degli Incubi (in lingua originale. "Nightmare Night"), una sorta di Halloween che ricorre annualmente in Ponyville[37]. In questa occasione, vengono offerti dolci a una statua di Nightmare Moon per placare la sua fame ed evitare che «divori i pony in un sol boccone». Durante la Notte degli Incubi successiva al suo ritorno, Luna si manifesta ai pony di Ponyville, che però ne sono spaventati: la principessa, infatti, essendo rimasta sola per un millennio, adotta un modo di fare "antiquato", adoperando espressioni e termini arcaici (ad esempio pray tell, thou, speakest, nay, hath), riferendosi a se stessa con il plurale majestatis (the royal we) e parlando con un tono fortissimo e intimidente (the traditional Canterlot voice, "la voce tradizionale di Canterlot"). Grazie all'aiuto di Twilight, tuttavia, Luna impara man mano a integrarsi con gli altri pony e a imparare che cosa sia il divertimento, prima a lei sconosciuto. Luna compare in diverse occasioni a seguito della Notte degli Incubi. Durante il matrimonio di Shining Armor e Princess Cadance, ella ha il compito di sorvegliare la città di Canterlot durante la notte[59]; quando Celestia invia Twilight all'Impero di Cristallo per sventare la minaccia di Re Sombra, Luna si offre volontaria ad andare anch'ella, temendo per la buona riuscita della missione[18]. Successivamente, Luna soccorre Scootaloo quando questa è in preda agli incubi, affermando che, in quanto principessa della notte, «è suo dovere venire nei [suoi] sogni»; in seguito, Scootaloo vede il profilo della principessa stagliarsi sulla luna, e ode la sua voce darle un consiglio[24]. Nel finale della terza stagione, Luna è presente assieme a Cadance alla solenne cerimonia d'incoronazione della principessa Twilight Sparkle[4].